figure 2: dépôt des sondes

Dans une première étape plusieurs milliers de fragments d’Adn caractéristique des cellules du sein sont  extraits d'une banque de clonage. L'ADN de chaque gène est amplifié par une méthode d'amplification très fiable nommée PCR. Cette méthode permet de copier en un grand nombre d’exemplaires des séquences d’ADN à partir d’une faible quantité d’acide nucléique au départ.

Ils sont ensuite dénaturés, en un simple brin. Cet Adn est appelé Adn complémentaire (Adn c), ou sonde. Ceux-ci sont immobilisés sur la surface de la puce à l’aide d’un robot.  Chaque emplacement de séquence nucléotidique  est soigneusement annoté.  Elles sont disposées à une densité de 1000 sondes/cm2. Au total la puce peut contenir l'ensemble du génome de la cellule soit prés de 30 000 gènes.

On extrait ensuite un fragment d’ADN  de deux groupes de cellules, un échantillon cellulaire mammaire  d’une patiente saine  et un échantillon cellulaire mammaire d’une patiente atteinte d’une tumeur du sein. 

On prélève des brins d’ARN (molécule qui transfère l’information génétique du noyau au cytoplasme). Ces ARN sont également amplifiés par PCR puis  transcrit en ADNc  c’est « la transcription inverse ». La quantité d’ARN prélevé doit être proportionnelle à la quantité d’ADNc fixée sur la puce lors de la première étape.

Sur chacun des échantillons on intègre un marqueur fluorescent spécifique (par exemple : le vert pour le fragment d’ADN extrait du tissu sain et rouge pour le tissus tumoral.) Cette opération est répétée pour l’ensemble des gênes étudiés, appelés cible.

La puce est alors plongée dans un milieu liquide où chacune des cibles va se lier précisément à sa sonde complémentaire. Cette étape est appelé l’hybridation, elle peut durer quelques heures.  Elle est ensuite « lavée », cela  permet d’éliminer les brins non complémentaires, et ainsi enlever les nombreux signaux non spécifiques.

La puce est ensuite passée au scanner. Celui-ci est muni d’un laser qui excite les molécules fluorescentes et détecte ainsi le signal émit.
On obtient alors deux images:
L'échantillon sain marquée préalablement par un fluorescent vert indique une échelle d'intensité de fluorescence plus ou moin importante suivant les gènes
L'échantillon tumoral marqué par un fluorescent rouge indique une intensité différentes suivant les gènes.

dont l'intensité des spots varie du vert au rouge en passant par le noir. Un spot vert indique une sous-expression du gène. Un spot rouge une surexpression. an

On décide alors de superposé les images, on obtient une composition de spots allant du vert au rouge en passant par le jaune (fragment d’ADN dont l’intensité est similaire dans les deux échantillons).
La liste des gènes est ensuite filtrées afin d’éliminer les résultats les moins fiables.  Ainsi les gènes ayant une intensité extrêmement faible, ou pour lesquels on suspecte une hybridation non spécifique sont extrait de la puce.

Il est désormais important de quantifier le niveau d’expression des gènes.  Pour cela on mesure la quantité de signal dans le vert et la quantité de signal dans le rouge.  On évalue ensuite le ratio fluorescence rouge/ fluorescence vert de chaque gène.  Si ce ratio est supérieur à 1 (rouge sur l’image) alors le gène est surexprimé dans l’échantillon tumoral. Dans le cas contraire si ce ratio est inférieur à 1 (vert sur l’image), le gène est moins exprimé dans cette culture. Enfin si ce ratio est proche de 1 (jaune), alors le gène est exprimé de la même manière dans les deux cultures étudiées.